Як проводиться молекулярне профілювання пухлини: етапи та особливості
Автори
Молекулярне профілювання пухлин — складний процес, який включає численні етапи: від забору біологічного зразка до біоінформатичного аналізу геномних даних та їхньої клінічної інтерпретації. Це дозволяє приймати обґрунтовані клінічні рішення у сфері персоналізованої онкології, щоб підібрати найефективніші методи лікування з урахуванням індивідуальних особливостей пухлини кожного пацієнта.
Етапи молекулярного профілювання
Першим етапом молекулярного профілювання є забір зразка пухлини. Це може бути матеріал, отриманий під час біопсії або операції. Важливо, щоб цей процес відбувався правильно, адже від нього залежить якість нуклеїнових кислот, аналіз яких буде відбуватися.
Збереження нуклеїнових кислот вимагає бережливого відношення до біологічних зразків. Щоб мінімізувати термін холодової ішемії, біоматеріал швидко занурюють у фіксатор. Це важливо, бо подовження терміну холодової ішемії більш ніж на 30 хвилин зменшує шанси на проведення молекулярного профілювання.
Вчасна фіксація запобігає аутолізу та фрагментації нуклеїнових кислот. В якості фіксатора використовується розчин формаліну — це має бути 10% нейтральний забуферений формалін.
Окрім вимог до якості формаліну, важливо також дотримуватися оптимального терміну фіксації, який становить від 6 до 48 годин, залежно від обсягу матеріалу. Проте, у будь-якому разі, тривалість фіксації не повинна перевищувати 72 години. Після цього відбувається обробка матеріалу та виготовлення парафінових блоків.
Важливо впевнитися, що в представленому зразку є пухлина і що в ньому достатньо пухлинних клітин. У разі невідповідності гістологічного діагнозу, недостатньої кількості пухлинних клітин чи наявності некрозів зразок може бути відхилений від проведення молекулярного профілювання.
Більше дізнатися про важливість преаналітичного етапу та факторів, що впливають на якість ДНК, можна у відео.
Після попереднього контролю якості блок з пухлиною передається у молекулярну лабораторію. Тут відбувається багатоетапна підготовка до секвенування.
- В першу чергу проводиться екстракція ДНК, яка передбачає виділення геномної ДНК (або РНК) з відповідним контролем якості виділених нуклеїнових кислот.
- Наступним кроком є підготовка бібліотек. Геномну ДНК фрагментують, і фрагменти з’єднують зі специфічними адаптерами, утворюючи бібліотеку. Кожен адаптер має свій молекулярний «штрих-код», що маркує кожну унікальну послідовність ДНК. Це дозволяє секвенувати одночасно кілька зразків.
- Надалі для збагачення ділянок інтересу проводять ампліфікацію бібліотек (створення великої кількості копій певних фрагментів ДНК) методом ПЛР.
- Потім виконується власне процес секвенування (NGS), яке може здійснюватися на різних платформах. Для діагностичних цілей в онкології найбільш високопродуктивними та точними є Illumina.
Отримані дані проходять суворий контроль якості. Секвеновані ряди вирівнюють до референсного геному за допомогою сучасних алгоритмів.
На основі аналізу даних визначаються різні варіанти генетичних порушень, включаючи соматичні мутації, варіації кількості копій (CNV), інсерції/делеції та реаранжування генів.
Виявлені варіанти анотують за допомогою відповідних баз даних (ClinVar, COSMIC, OncoKB), на основі чого проводиться оцінка клінічного значення виявлених порушень. Цей крок є критично важливим для трансляції даних молекулярного профілювання у рекомендації для прийняття клінічних рішень.
На основі аналізу результатів секвенування та клінічного значення виявлених генетичних порушень формується репорт, який містить опис ключових генетичних знахідок, їхню інтерпретацію щодо прогнозу та предикції потенційних терапевтичних мішеней.
Що робити, якщо не можна виконати молекулярне профілювання через недостатню якісь матеріалу пухлини?
У такому випадку є три сценарії дій:
- Не виконувати молекулярне дослідження, а отже, позбавити пацієнта шансу на персоналізоване лікування та застосувати стандартний протокол.
- Отримати альтернативний матеріал — через перезабір матеріалу або, у випадку наявності серії біопсій або оперативних втручань, спробувати відібрати найбільш репрезентативний блок, який може бути використаний для генетичного дослідження.
- Розглянути можливість проведення молекулярного тестування на основі рідкої біопсії (за оцінкою циркулюючої пухлинної ДНК).
Позитивним моментом щодо альтернативного матеріалу є те, що для NGS-тестування достатньо обмеженої кількості нуклеїнових кислот, тому таке дослідження успішно проводиться на дрібних зразках (аспіратах, малих резектатах).
Скільки часу займає отримання результатів?
Враховуючи багатоетапність молекулярного профілювання, зазвичай таке дослідження займає від 7 до 30 днів. Все залежить від типу та якості зразків, які потрапили на дослідження, організації робочих процесів у лабораторії та типу NGS-панелей, які застосовуються для тестування.
Наскільки доступне це дослідження в Україні?
Наразі NGS-дослідження є відносно доступними в Україні і виконуються в кількох державних та приватних закладах охорони здоров'я. У 2025 році NGS-тестування включено до переліку генетичних досліджень у Пакеті медичних гарантій «ПРОФІЛАКТИКА, ДІАГНОСТИКА, СПОСТЕРЕЖЕННЯ ТА ЛІКУВАННЯ В АМБУЛАТОРНИХ УМОВАХ» у рамках сервісу «Лабораторні дослідження. Клас Генетика».
Заклади, які підписали договір з НСЗУ за пакетом «ПРОФІЛАКТИКА, ДІАГНОСТИКА, СПОСТЕРЕЖЕННЯ ТА ЛІКУВАННЯ В АМБУЛАТОРНИХ УМОВАХ», включаючи клас лабораторних досліджень «Генетика», можуть надавати безоплатно послуги з молекулярного профілювання при наявності відповідних показань і направлення від онколога.
Крім того, в Україні проводиться низка проектів з безоплатного генетичного тестування хворих на різні форми раку. Приклади таких проектів можна знайти тут.
Чи завжди результати молекулярного профілювання є точними?
Будь-яке дослідження в медицині має свої обмеження та певні параметри чутливості та специфічності, які визначають точність. Аналітична чутливість та специфічність для таргетних NGS-панелей (панелей, що охоплюють певний набір клінічно значущих генів) часто перевищують 98–99% щодо визначення точкових мутацій та малих інсерцій/делецій за умови високоякісної ДНК.
Варто зазначити, що точність молекулярного профілювання залежить від якості зразка, характеристик панелі (глибини читання і покриття), дизайну аналізу та специфіки біоінформатичного аналізу, який використовується для обробки даних.
Для досягнення високої точності кожен зразок має проходити ретельну оцінку якості, що забезпечує відповідність даних високим стандартам і підтверджує достовірність отриманих результатів.
Для клінічного застосування важливо використовувати клінічно валідовані рішення та панелі, а також проводити лабораторні дослідження в акредитованих лабораторіях. Окрім внутрішньої системи контролю якості, важливо, щоб лабораторія, яка виконує молекулярне профілювання, проходила незалежний зовнішній контроль якості. Для України це міжнародний контроль якості акредитованими агентствами, наприклад, QCMD.
Чи можуть бути побічні ефекти або ризики, пов’язані з цим аналізом?
Хоча молекулярне профілювання є потужним інструментом персоналізації менеджменту онкопацієнтів, воно дійсно може супроводжуватися певними негативними ефектами та ризиками.
Окрім психологічного впливу невизначеності очікування результатів, варто відзначити, що в певних випадках молекулярне профілювання не виявляє клінічно значущі варіанти, що обмежує можливості застосування таргетної терапії. Іноді під час профілювання виявляються несподівані мутації або порушення, які не стосуються напряму основного захворювання. Крім того, отримання генетичної інформації щодо порушень у певних генах потребує додаткового тестування на носійство спадкових мутацій, які можуть впливати на схильність до інших видів раку чи генетичних захворювань не лише у пацієнта, а й у членів його родини, що може призвести до значного емоційного стресу. Це психологічне навантаження може вплинути не лише на самого пацієнта, а й на його родину, яка також може бути під ризиком.
Тому перед проведенням дослідження важливо надати пацієнту та його родичам детальну інформацію про потенційні результати і невизначеності молекулярного профілювання.
Крім того, як і будь-які генетичні тести, ці дослідження зачіпають питання конфіденційності та безпеки персональних даних, що є чутливими. Для уникнення витоку інформації або її несанкціонованого використання (наприклад, генетичної дискримінації у сфері працевлаштування або страхування), важливим є застосування в закладах охорони здоров'я лабораторних інформаційних систем та суворе дотримання законодавства щодо захисту персональних даних.
Незважаючи на високі показники точності, молекулярне профілювання може давати хибнопозитивні або хибнонегативні результати. Певні технічні обмеження, низька якість зразка, недостатня глибина секвенування або помилки у біоінформатичному аналізі та інтерпретації даних можуть призводити до надання некоректних результатів. Це має критичні наслідки для прийняття рішень щодо лікування.
Нарешті, комплексне молекулярне профілювання є дороговартісним дослідженням. Вартість дослідження може обмежувати доступ для деяких пацієнтів, а хибні або невизначені результати можуть призводити до додаткових витрат на наступні обстеження.
Це додатково висуває вимоги щодо дотримання якості на всіх етапах молекулярного дослідження.
Що слід знати пацієнтам, які розглядають можливість молекулярного профілювання?
В більшості випадків діагноз «рак» є складною подією в житті пацієнта та родини, що викликає сильний стрес і страх. Тому надзвичайно важливо отримати повну інформацію щодо стану здоров'я, діагнозу, стадії онкологічного захворювання, прогнозу та варіантів діагностики та лікування. Це підкреслює важливість комунікації з професіоналами в сфері онкологічної допомоги.
Обговоріть усе, що стосується діагнозу, з вашим онкологом. Дізнайтеся, з якою метою проводиться молекулярне профілювання і як це може допомогти у визначенні молекулярних мішеней для персоналізації лікування.
Важливо бути готовим як до виявлення генетичних порушень, так і до варіанту, коли результати молекулярного профілювання не виявляють клінічно значущих альтерацій. Крім того, при застосуванні комплексного геномного профілювання (300+ генів) можуть бути виявлені генетичні порушення, які не впливають безпосередньо на вибір таргетної або імунотерапії, але можуть впливати на прогноз або знаходяться на етапі дослідження.
Для обмеження фактору невизначеності важливо розуміти, що молекулярне профілювання — це складний і тривалий метод дослідження. Розуміння цього допоможе спланувати дії й уникнути стресу від очікування.
Також слід з’ясувати, який саме тип NGS-тестування вам рекомендують і які гени будуть проаналізовані. У разі наявності різних варіантів важливо розуміти переваги та обмеження кожного з них.
Якщо у вас немає повного розуміння потреби, можливостей та обмежень молекулярного профілювання, ви можете звернутися за генетичною консультацією. Така консультація проводитися перед та/або після молекулярного профілювання. Перед тестуванням генетик розповість, чи доцільним є молекулярне профілювання, і який саме варіант тестування є необхідним і достатнім для вашої конкретної ситуації.
Після проведення молекулярного тестування медичний генетик допоможе зрозуміти клінічну значущість виявлених порушень, їхній вплив на режим спостереження, обсяг оперативного втручання та чутливість до різних варіантів системної терапії. Ці дані є важливими для подальшого спільного з клініцистом прийняття рішень щодо лікування.